2.1. Ablación experimental

Consiste en destruir una parte del encéfalo y evaluar la conducta subsecuente del animal. En la mayoría de los casos dicha técnica no implica extraer el tejido cerebral, el investigador destruye algo de tejido y lo deja en su sitio.

Evaluación de los efectos comportamentales del daño cerebral

Los experimentos en los que se daña una parte del encéfalo y después se observa la conducta del animal se llaman estudios de lesión. Su fundamento teórico es que la función de un área cerebral puede deducirse basándose en las conductas del animal ya no puede realizar tras haber sido destruída dicha área. Nuestro objetivo es descubrir cuáles son las funciones que cumplen las diferentes regiones cerebrales y luego entender cómo se combinan estas funciones para dar lugar a determinadas conductas. La distinción entre función cerebral y conducta es importante: los circuitos que hay en el encéfalo realizan funciones, no conductas. Cada región desempeña una función que contribuye a la ejecución de la conducta. La interpretación de los datos de los estudios de lesión se complica porque todas las regiones del encéfalo están conectadas entre sí.

Realización de lesiones cerebrales

Las lesiones cerebrales de regiones subcorticales se realizan por lo general haciendo pasar una corriente eléctrica a través de un electrodo. Se guía éste de modo que su extremo llegue al lugar adecuado. El paso de la corriente a través del tejido cerebral produce una alta temperatura que destruye las células cercanas a la región que rodea la punta del electrodo. Las lesiones producidas con este método destruyen todo lo que se encuentra en las cercanías de la punta del electrodo; somas neuronales y axones de neuronas que atraviesan la región.

Un método más selectivo es emplear un aminoácido excitador como el ácido caínico que destruye las neuronas estimulándolas hasta destruirlas. A este tipo de lesiones se les llama lesiones excitotóxicas. Cuando se inyecta a través de una cánula un Aa excitador destruye los somas celulares vecinos, pero no los axones de las diferentes neuronas que pasan por alrededor.

Se dispone incluso, de métodos específicos para marcar y lesionar un tipo determinado de neuronas, los biólogos moleculares han ideado procedimientos para incorporar sustancias químicas tóxicas a los anticuerpos, los cuales se unirán con determinadas proteínas que se encuentran solo en ciertos tipos de neuronas del cerebro. Los anticuerpos alcanzan estas proteínas y las sustancias químicas tóxicas destruyen las células a las que están unidas esas proteínas.

Cuando se producen lesiones subcorticales siempre se causan daños adicionales en el encéfalo.

Inevitablemente se produce un cierto grado de lesión incluso antes de activar el dispositivo de lesión o de iniciar la infusión. No podemos limitarnos a comparar la conducta de los animales lesionados con la de animales de referencia intactos, puede que la causa de alguna de las alteraciones comportamentales sea el daño fortuito de las regiones cerebrales por encima de la lesión. Lo que se hace es una lesión falsa: se hace lo mismo que se haría para producir la lesión, excepto activar el dispositivo de lesión o iniciar la infusión. Este grupo de animales sirve de grupo control: si la conducta de los animales con lesión es diferente de la de los animales control se puede concluir que las lesiones son la causa de las alteraciones comportamentales.

Cirugía estereotáxica

Un aparato estereotáxico consta de un soporte que inmoviliza la cabeza del animal en una posición establecida y un brazo que desplaza el electrodo o la cánula en los tres ejes espaciales a lo largo de distancias cuantificables.

El atlas estereotáxico

No existen dos encéfalos de animales de la misma especie completamente idénticos, pero la semejanza entre los individuos es suficiente para predecir la localización de una estructura cerebral concreta respecto a las características externas de la cabeza. Un atlas estereotáxico incluye fotografías o esquemas que corresponden a secciones frontales, tomadas a diferentes distancias rostrales y caudales a bregma. Cada página del atlas estereotáxico está identificada conforme a la distancia de la sección anterior o posterior respecto a bregma y, la cuadrícula de cada página indica las coordenadas de las estructuras cerebrales en el plano ventral a la parte superior del cráneo y lateral a la línea media.

Así, localizando una estructura neural en una de las páginas se peude determinar su localización respecto a bregma. Por variaciones en la cepa y edad de los animales, la localización que proporcionan los atlas es solo aproximada, siempre hay que probar con una nueva serie de coordenadas, seccionar y teñir el encéfalo del animal, comprobar la localización exacta, corregir los valores y volver a intentarlo.

El instrumento estereotáxico

El dispositivo incluye un soporte para la cabeza, otro para el electrodo y un mecanismo de graduación por el que se mueve éste a lo largo de los tres ejes espaciales: anterior-posterior, dorsal-ventral y lateral-medial.

La cirugía estereotáxica puede usarse para otros fines: los electrodos pueden emplearse tanto para estimular neuronas como para destruirlas y se pueden inyectar fármacos que estimulen neuronas o bloqueen receptores específicos. También hay equipos estereotáxicos para seres humanos.

Por lo general se valen de múltiples puntos de referencia y verifican la localización del electrodo insertado en el encéfalo tomando imágenes de RM o regustrando las actividades de las neuronas en esta región antes de producir la lesión.

Métodos histológicos

Fijación y obtención de cortes

Si se quiere estudiar el tejido tal como era en el momento de la muerte del animal, se han de destruir las enzimas autolíticas, o sino éstas convierten al tejido en una masa deforme. También se tiene que evitar que se descomponga por la acción de bacterias o mohos, sumergiéndolo en un fijador (el más frecuente es el formol). Pero antes de ponerlo en una solución fijadora se perfunde. La perfusión supone extraer la sangre y sustituirla con otro líquido. El encéfalo del animal se perfunde porque se obtienen mejores resultados histológicos cuando no hay sangre.

Una vez fijado el encéfalo, se secciona en delgadas láminas y se tiñen diversas estructuras celulares. Las secciones se efectúan con un micrótomo (consta de tres partes: cuchilla, plataforma donde reposa el tejido y un mecanismos que hace avanzar la cuchilla). Las secciones se montan sobre portaobjetos de vidrio, y entonces pueden teñirse sumergiendo el portaobjetos en soluciones químicas. Las secciones teñidas se cubren con un líquido transparente llamado medio de montaje y se coloca un cubreobjetos sobre ellas.

Tinción

La neuroanatomía microscópica requiere tinciones histológicas específicas. Los investigadores han creado muchas tinciones para identificar sustancias específicas en el interior o exterior de las células. Para verificar la localización de una lesión cerebral se utilizará una de las más simples: la tinción de los somas celulares.

Además del azul de metileno se pueden usar muchos tintes para teñir los somas celulares, el más usado es el violeta de cresilo.

El descubrimiento de las tinciones de somas celulares hizo posible identificar masas nucleares en el encéfalo. La tinción no tiñe selectivamente los somas celulares neuronales: todas las células quedan teñidas por igual. Le corresponde al investigador determinar cuál es cuál, en función de tamaño, forma, y localización.

Microscopia electrónica

Para poder ver las estructuras anatómicas tan pequeñas como las vesículas sinápticas y detalles de los orgánulos celulares, los investigadores han de usar un microscopio electrónico de transmisión.

Un microscopio electrónico de barrido proporciona menos amplificación que un microscopio electrónico de transmisión estandar, el cual transmite el haz de electrones a través del tejido. En cambio, muestra los objetos en tres dimensiones.

Microscopio confocal con láser

La microscopia convencional requiere que el tejido se corte en finas secciones, la invención del microscopio confocal con láser permitió ver detalles en el interior de secciones gruesas de tejido o incluso en bloques de tejido. El microscopio confocal requiere que se tiñan con un tinte fluorescente aquellas células o partes de la célula que nos interesan. Si se realizan múltiples exploraciones mientras se mueve la localización de la abertura, se puede obtener un cúmulo de imágenes de secciones a través del tejido.

Marcado de conexiones neurales

Una vez que se sabe que una determinada región del encéfalo interviene en el control de una determinada función cabe preguntarse cuáles son las estructuras que le aportan información y cuáles la reciben de ella.

Marcado de axones eferentes

Para marcar éstos se usa un método de marcado anterógrado. Éste método usa sustancias que son captadas por las dendritas o los somas celulares y las transportan a lo largo del axón hasta los botones terminales. En pocos días las células están repletas de moléculas. Entonces se sacrifica al animal, se secciona su encéfalo y se acoplan las secciones sobre portaobjetos. Para poder ver las moléculas se aplica un método inmunocito- químico especial y las preparaciones se examinan al microscopio. (los métodos inmunocitoquímicos sacan provecho de las reacciones inmunitarias).

Los biólogos ponen a punto métodos de producción de anticuerpos para cualquier péptido o proteína. Las moléculas de los anticuerpos están unidas a diferentes tipos de moléculas colorantes, algunos reaccionan con otras sustancias y tiñen el tejido, mientras que otros son fluorescentes: brillan cuando son expuestos a una luz de determinada longitud de onda. Para determinar en qué parte del encéfalo se localiza el péptido o la proteína (Ag), los investigadores sumergen secciones en una solución que contiene colorante y los Ac se unen a su Ag. Cuando el investigador examine las secciones con un microscopio podrá ver cuáles son las partes del encéfalo que contienen el Ag.

Marcado de axones aferentes

Para saber cuáles son las regiones del encéfalo que forman parte de los componentes de la “corriente superior” de los circuitos neurales, se ha de determinar cuáles son sus conexiones aferentes. Para hacerlo, se empleará un método de marcado retrógrado. Emplean sustancias que son captadas por los botones terminales y transportadas de vuelta a lo largo de los axones hacia los somas celulares. Días después se sacrifica al animal, se secciona su encéfalo y se examina el tejido bajo una luz de la longitud de onda adecuada.

Los métodos de marcado anterógrado y retrógrado identifican un solo eslabón de una cadena de neuronas, mientras que los métodos de marcado transneural identifican una serie de neuronas que forman conexiones sinápticas en serie una con otra. El método de marcado transneural retrógrado más eficaz emplea un virus de la seudorrabia. Para el anterógrado se usa una variedad del virus del herpes simple.

Cuanto más espere el investigador tras inyectar el virus, mayor será la cantidad de neuronas que lleguen a infectarse. Después de que se haya sacrificado el animal y se haya seccionado su encéfalo, se aplican métodos inmunocitoquímicos para localizar una proteína producida por el virus.

Estudio de la estructura del cerebro humano in vivo

Los recientes avances en las técnicas de rayos X y en la tecnología de los ordenadores han llevado a concebir varios métodos para estudiar la anatomía del cerebro in vivo. Estos avances permiten a los investigadores examinar la localización y extensión de la lesión cerebral mientras el paciente está aún vivo. El primer método que se ideó recibió el nombre de tomografía axial computarizada.

Una radiografía incluso más detallada de lo que hay en el interior de la cabeza de una persona la proporciona una técnica conocida como resonancia magnética (RM). El equipo se parece al del TAC pero no usa rayos X. En su vez, hace pasar un campo magnético muy intenso a través de la cabeza del paciente.

A diferencia de las imágenes de TAC, que se limitan a un plano horizontal, las de RM pueden obtenerse también en plano sagital o frontal. En las imágenes de RM se puede distinguir entre las regiones de sustancia gris y las regiones de sustancia blanca, de modo que pueden verse los principales fascículos de fibras.

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